今日公布排名名单dna更简单的检测方法

一、dna是怎么验

在国内，除了为海外定居、旅行、登记和亲子鉴定，的财产分割提供亲子关系程序之外，一些亲子鉴定已经成为检验妻子或丈夫忠诚度的“试金石”。下面是对更简单的亲子鉴定方法的详细介绍。

亲子鉴定运用学、生物学和遗传学的理论和技术，从后代和父母在形态和生理上的相似特征来分析遗传特征，判断父母和子女是否是亲生关系。以下是更简单的亲子鉴定方法的详细介绍。

成之嘉提醒：要做亲子鉴定，你必须选择正规!的鉴定机构目前很多鉴定机构以低价吸引客户，但鉴定的低成本往往是因为鉴定设备和鉴定试剂成本相对较低，使得结果in亲子鉴定的准确性无法得到有效保障。下面是对更简单的亲子鉴定方法的详细介绍。

下面是对更简单的亲子鉴定方法的详细介绍。

DNA亲子鉴定的方法有哪些？

1、SNP(单核苷酸多态性)

SNP已成为代遗传标记，人体内许多表型差异和对药物或疾的易感性可能与SNP有关。

2、DNA指纹

DNA指纹是DNA指纹的一种高度可变且稳定的遗传，目前仍以简单的孟德尔方式遗传。它已成为更具吸引力的遗传标记，并在亲子鉴定广泛使用

3、RFLP分析

RFLP标记是更早发展起来的DNA标记技术。可以测量限制性图谱标记和可见表型重组的频率，遗传图谱可以分为基因型和表型分子标记。RFLP指的是基因型之间限制性片段长度的差异，这是由限制性位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变引起的。

4、STR检测

近年来，检测短串联重复序列技术在国内得到应用。STR是人体内的一段染色体，以2 ~ 5个碱基为核心重复。每个人重复次数不同，是有遗传性的。

由于其基因片段短、扩增效率高、分型准确，被称为第二代DNA指纹，近年来在亲子鉴定得到广泛应用。

只要在检测，有多个STR基因座就可以鉴定个体，然后DNA检测就可以应用到实际工作中。

DNA亲子鉴定方法有几种？

根据不同的人和需要，DNA亲子鉴定又被细分为个人亲子鉴定，亲子鉴定和个人胎儿亲子鉴定。其中，胎儿亲子鉴定也可以被称为个人亲子鉴定，他们有一个共同点，即他们没有效力。鉴定结果仅供个人参考。

个人亲子鉴定怎么做？个人亲子鉴定方法。更简单的亲子鉴定方法是什么

亲子鉴定，也叫匿名亲子鉴定，可以发到自己，私下采集，的样本，鉴定人，然后匿名邮寄到鉴定中心完成DNA鉴定，所以个人亲子鉴定可以保护委托人和鉴定人，甚至一个人也可以亲子鉴定of偷偷完成。

亲子鉴定怎么做？亲子鉴定方法。

与亲子鉴定，相反，亲子鉴定是公开透明的，在亲子鉴定，完成不能单独发送。当然，不能匿名邮寄。亲子鉴定要求从鉴定人到鉴定中心的所有申请都要经过处理。在此期间，需要核实身份、拍照和记录指纹。实名制是亲子鉴定，完成由于其公开透明，亲子鉴定具有效力，可以直接用于、出国、留学、协商等。

胎儿亲子鉴定怎么做？胎儿亲子鉴定方法。

胎儿亲子鉴定是孕期之间完成的亲子鉴定，有三个胎儿亲子鉴定方法，分别是羊水亲子鉴定，绒毛亲子鉴定和胎儿亲子鉴定，隐私羊水亲子鉴定和绒毛亲子鉴定属于传统的产前亲子鉴定，所以需要去三甲做手术，采集，样本，完成和2828、羊水亲子鉴定和绒毛亲子鉴定处于危险之中，可能对孕妇和胎儿造成伤害，而胎儿亲子鉴定，隐私可以100%保证胎儿和孕妇的安全，胎儿亲子鉴定，隐私是目前的主要城。

首先，类是个人亲子鉴定，即当自己质疑亲子关系时，他想悄悄地进行一次鉴定。这种鉴定不需要提供身份信息，只需要提供鉴定人检查的材料亲子鉴定个人知识只负责材料检查，不具有效力。只有自己知道结果，不能用于协商、、出国等合法渠道。成本相对便宜。

其次，第二类是鉴定，通常用于程序，或儿童的和国外出国。这种鉴定需要被鉴定人提供身份证明，被鉴定人双方需要到鉴定所采集样本，拍照留指纹。费用比个人鉴定高一些。

亲子鉴定是如今科学验证dna 的方式，对于亲子鉴定的价钱也是很多人所关注的。通常来说：

1、个人亲子鉴定，受理简单，报告仅供自己了解，父子两人2000元。

2、鉴定属于公开的鉴定，鉴定报告具有效力，父子两人3000元。这个各省份都有不同的标准，而且同一省不同机构收取的费用也不完全相同，如果是自己想进行亲子鉴定，可以直接到鉴定机构相关费用，如果是用于落户等用途，可以到相关部门进行。

怎么选择正规机构？

一、鉴定机构的口碑：

二、鉴定机构的设备：

亲子鉴定机构当然要具备DNA实验，这一点更重要，没有实验的鉴定机构都是冒的，也只有具有DNA实验，并且由当地厅考核合格后才能开始营业。实验设备比较贵重，主要有PCR扩增仪、ABI毛细管电泳仪，价值百万以上，选择DNA亲子鉴定机构时，一定要看其是否有实验。

三、鉴定机构的：

在选择亲子鉴定机构的时候患者首先是要看是否正规，除此之外，就要看的是否比较专注。因为对于疾的治疗，如果是专注的就知道如何可以更好地做亲子鉴定，而且好的鉴定机构也必须有专注的团队，实力强大的资深团队，这样才能更准确的做出亲子鉴定。

二、dna检测方法有哪几种

现在做亲子鉴定更简单实用的方法是什么?随着医疗水平的不断提升和生物学遗传学技术的日新月异，亲子鉴定方法在历史的车轮中也留下了属于它的足迹，下面我们就一起来了解一下不同时期具有代表性的亲子鉴定方法：

1、滴血验亲

古代滴血认亲”的方法，分为两种，一是叫滴骨法，另一种叫合血法。滴骨法，早在三国时期就有实例记载，是指将活人的血滴在死人的骨头上，观察是否渗入，如能渗入则示有父母子女兄弟等血统关系；合血法，则大约出现在明代，是指双方都是活人时，将两人刺出的血滴在器皿内，看是否凝为一体，如凝为一体就说明存在亲子兄弟关系。

【评价】滴骨验亲和合血法，按现代学理论分析，都缺乏科学依据。不可以判断生物学关系。

2、血型测试

一般我们会想到的是检查血型。检查小孩父亲和母亲的血型，检查小孩的血型。这样就可以初步确定小孩是否是自己的小孩了。

【评价】如果从科学角度来讲，这种方法是完全不科学的，只能作为参考。而想要准确又科学的答案还是学检查基因。

3、DNA亲子鉴定

DNA亲子鉴定就是利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系。

【评价】鉴定亲子关系用得更多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定，十分方便。

亲子鉴定更简单方法

目前上公认的更准确更权威的亲子鉴定方法就是DNA亲子鉴定，其肯定亲子关系的准确率高达99.99%以上，否定亲子关系的准确率几近100%。

亲子鉴定分为个人亲子鉴定和亲子鉴定两种，更简单的还是个人亲子鉴定，因为它可以不提供证件、照片等，只要提供被鉴定人的样本。鉴定中心一般都会接受您所提供的样本的亲子鉴定委托。对鉴定的准确率负有责任。个人亲子鉴定可以自己提供样本，也可以到鉴定中心采样，个人亲子鉴定完全保护客户，可以匿名，需要提醒的是，个人亲子鉴定的报告是没有效力的，结果仅供自己参考。

DNA亲子鉴定的方法有哪些?

1、SNp方法(单核苷酸多态性)

SNp成为代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾的易感性等等都可能与SNp有关。

2、DNA指纹方法

DNA指纹是DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前更具吸引力的遗传标记，广泛用于亲子鉴定。

3、RFLp分析方法

RFLp标记是发展更早的DNA标记技术。限制图谱标记和可见表型重组频率是可测量的，将遗传图谱分为基因型和表型两种分子标记。RFLp是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

4、STR检测方法

近年来，我国开始应用检测短串联重复(STR)技术。STR是人体中染色体的一段，它以2个至5个碱基为核心进行重复，每个人的重复次数不同，并且具有遗传性。

因其基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点，被称作第二代DNA指纹，近几年亲子鉴定多采用该方法。

只要检测多个STR位点，就可以做个体的认定，进而使DNA检测得以应用于实际工作中。

一个正规的鉴定机构应当具备以下条件：

2、看鉴定人是否具备亲子鉴定资格；

3、看认证机构是否有独立的实验；

4、看认证机构有没有CNAS和证书。看这些情况，去局或者厅查询。

常规样本有很多种：血痕、毛发(有毛囊的毛发)和口腔拭子(口腔粘膜细胞)。

特殊样本：烟头、羊水、指甲、口香糖、蜡块、牙刷、牙齿、肌肉组织、经血、流鼻血、纯精子斑、胎儿流制品、混合精子斑等。

三、dna如何检测

做亲子鉴定更简单的方法，如何操作，亲子鉴定指南，正常情况下，人一共有23对染色体，每一对都是两条，一般都分别来自于父亲和母亲。检测的时候只要对一定数量的DNA位点做检测，如果分别和父母一样，那么就是亲生的，否则就存在疑问了。如果只有1-2个位点不匹配，就要加做一些位点的检测，因为有基因突变的可能。3个以上的位点不匹配，基本上就不是亲子关系。

一、做亲子鉴定更简单的方法流程

1、选取样本

样本可以是很多种，首先比较简单的是血痕，买一包医用棉签，将血液滴在上面就可以了；也可以是口腔拭子，取医用棉签，在口腔上壁擦拭一圈，再自然风干即可；当然，为了防止对方发现，可以取头发、烟头、嚼过的口香糖、喝过的水杯等。

2、样本封存

样本封存的原则是通风透气，取样本后，一般采取自然风干的方式，再用纸质信封保存。

3、样本标记

样本要写清楚是哪个的，清楚的写明是孩子、父亲、母亲的样本。

做亲子鉴定更简单的方法是检测血型还是位点？亲子鉴定机构指南

4、样本送检

样本送检的方式可以是亲自送到鉴定机构，也可以采用邮寄的方式。

5、等待结果

当样本送检后，就等待鉴定机构出结果吧，一般是5-7个工作日，成之嘉亲子鉴定中心更快3小时出检测结果。

6、鉴定报告书

鉴定完成后，报告书上有详细的介绍，标明鉴定对象是否存在血缘关系，当然很多人本身就做得比较隐秘，这个时候可以要求鉴定机构不出具鉴定报告书，只出具口头结果即可。

二、亲子鉴定种类

1、个人亲子鉴定：费用差异很大，一般都是民营机构多，这里还需要多做比较之后，再做决定。

个人鉴定属于私密的，鉴定流程比较简单，私密性比较强，客户可以匿名，个人鉴定不需要提供任何证件，来我们采样点采样或者自己采样都可以，但是个人鉴定的报告不具有效力。

做亲子鉴定更简单的方法是检测血型还是位点？亲子鉴定机构指南

三、简单做亲子鉴定种类

1、外貌对比

很多人是通过外貌对比来认定孩子是不是亲生的。仅仅通过外貌可以知道孩子是不是亲生的吗？当然不能，外貌只能作为参考依据，可以因此怀疑孩子非亲生，但是要想准确鉴定是不是亲生的，更好的更准确的方式还是做DNA亲子鉴定。

2、血型对比

父母和孩子的血型是一样的吗？只要弄清楚这个问题就会知道，孩子和父母的血型虽然遵循遗传规律，但是并不能判断亲生关系。同时血型容易发生遗传突变，判断起来就更难了。想要通过血型对比判断亲子关系，那么只能作为参考使用，真正准确的还是做DNA亲子鉴定。

3、滴血验亲

滴血验亲是古代的方法，经过科学验证已经被推翻了。滴血验亲是完全不能判断亲生关系的，也不能作为参考使用。想要准确知道跟孩子的亲生关系，还是做DNA亲子鉴定。

四、亲子鉴定准确率多少

只有DNA亲子鉴定才能准确判断亲生关系，且鉴定结果准确率99.9999%。

五、亲子鉴定几天出结果

一般5个工作日出结果，7个工作日发报告，加急更快3小时出结果，付款后实验收到样本就开始做实验。

四、dna更简单的检测方法是什么

亲子鉴定是许多朋友会进行的一种鉴定方式，更为精准的方式就是DNA亲子鉴定方式了。DNA亲子鉴定方式需要采用检测双方的血液、体表毛发、口腔细胞都可以，并且取样的方式也比较简单，剩下的就是等待结果的出来了。目前DNA亲子鉴定的方式可以达到接近100%的准确率。

亲子鉴定更简单方法有哪些

1、外貌对比

因为遗传的关系，所以如果是近亲，其相貌都有有一些相似的地方，这种通过看外貌来确定亲子关系应该是更传统的方法了。相应的这种方法准确性也比较差，现如今大家做个参考即可。

2、滴骨验亲

这种就是把血液滴在死者骨头上，来确定二者是否有血缘关系，如果血液能深入骨头，那么是有血缘关系。不过从现代医学角度来看，这种做法并不科学，但是它是更早通过血型匹配检测来确认亲子关系的方法。

3、滴血验亲

此法是古装电视剧上经常看到的方法，被鉴定者的血液融在一起就是亲生的，这种方法更早记载在宋代的著作里面。不过这个方法并没有科学性，事实上血液融不融在一起与是否为有血缘关系没什么关系。

怎么做亲子鉴定

1、DNA亲子鉴定

它是目前做亲子鉴定更常用方法，这种方法取样也比较简单，血液、体表毛发、以及口腔细胞都可以，非常方便。

原理：正常情况下，人一共有23对染色，每一对都是两条，一般都分别来自于父亲和母亲。检测的时候只要对一定数量的DNA位点做检测，如果分别和父母一样，那么就是亲生的，否则就存在疑问了。如果只有1-2个位点不匹配，就要加做一些位点的检测，因为有基因突变的可能。3个以上的位点不匹配，基本上就不是亲子关系。

2、血型亲子鉴定

这是给二者的血型做测试，对比他们的血型来辨别是否为亲生。

原理：孟德尔遗传定律指出，人类的血型会被遗传给下一代，所以子女的血型与父母的血型有着重要联系。目前有多种血型系统来可以鉴别出是否亲生，而检测的血型系统越多，那么准确度也越高。

此外，上个世纪专家们发现白血细胞的抗原也可以拿来做为参考数据，配合血型系统检测可以达到比较高的准确性。

3、染色体多态性亲子鉴定

这个是在上个世纪80年代发现的，医学家们根据通过染色体的多态性来辨别是否为亲生。

原理：正常人的染色体形态大多有些很微小的变异，而这种多态也是会遗传的。不过这项技术主要是技术人员观测并且做判断，所以准确度还不是很高

五、dna检测方法有哪些

Dna结合蛋白的检测方法

【专利】本发明公开了一种DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤：提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在Exo?III存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液；将消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应后得到扩增液；将纳米金颗粒溶液与含有检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育后得到纳米金检测探针溶液；将扩增液和纳米金检测探针溶液混合后对混合液进行检测，完成DNA结合蛋白的检测。这种DNA结合蛋白的检测方法，通过检测探针和第二检测探针与扩增产物中靶DNA的结合，使得结合了检测探针的纳米金颗粒发生聚集，导致混合液的颜色发生变化，现象直观，灵敏度较高。

【专利说明】DNA结合蛋白的检测方法

【技术领域】

[0001]本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种DNA结合蛋白的检测方法。

【背景技术】

[0002]简单灵敏的检测人体细胞中转录因子对于临床诊断以及药物的选有着重要的意义。目前的检测方法都是基于电泳迁移，免疫化学或者是荧光检测的方法，这些方法都是通过非扩增而直接进行检测，因此灵敏度较低。而且这些方法存在着放射性污染或者需要特异性抗体和荧光标记的探针，大大增加了实验成本和实验的复杂性。

[0003]DNA结合蛋白在基因组复制，基因转录，细胞分裂和DNA修复过程中起着至关重要的作用。而大部分的DNA结合蛋白都扮演着转录因子的角色，调节着细胞的发育，分化和增殖，由此转录因子也已经成为临床诊断和药物选中的靶点。目前为止绝大部分都是采用非扩增的直接检测的方法来定量转录因子，其中包括电泳迁移法(EMSA)，DNA酶足迹法；酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫印迹法(western blotting)和基于荧光能量共振转移(FRET)的方法。其中电泳迁移法(EMSA)和DNA酶足迹法属于传统检测方法，都是利用同位素标记DNA探针和凝胶电泳分离来检测DNA-蛋白复合物。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(western blotting)是通过抗原和抗体的特异性反应,然后经酶标抗体的底物显色反应来检测DNA结合蛋白。基于荧光能量共振转移(FRET)的方法则是利用DNA与蛋白的相互作用，使标记有荧光的两段DNA探针相互靠近而发生FRET;或者是标记有荧光的DNA探针与蛋白的相互作用后对DNA序列起到保护作用，外切酶Exo III不能进行切割DNA探针从而发生FRET，以此来检测DNA结合蛋白。然而，传统的DNA结合蛋白的检测方法灵敏度都偏低。

【发明内容】

[0004]基于此，有必要提供一种灵敏度较高的DNA结合蛋白的检测方法。

[0005]一种DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤:

[0006]提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在Exo III存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液，其中，未被Exo III切割的DNA的反义链作为引物被保留在所述消化液中；

[0007]将所述消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应，反应完全后得到扩增液，其中，所述扩增模板包括η段重复序列以及η-1段依次连接所述重复序列的连接序列，所述引物与所述重复序列特异性结合，所述连接序列包括所述内切酶的酶切位点，η为不小于2的整数，所述引物扩增后得到所述扩增模版的互补序列，所述扩增模版的互补序列被所述内切酶切割形成η段包含所述重复序列的靶DNA ；

[0008]提供纳米金颗粒溶液，并将所述纳米金颗粒溶液与含有检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育，孵育完成后得到纳米金检测探针溶液，其中，所述检测探针与所述靶DNA特异性互补，所述第二检测探针与所述靶DNA特异性互补；

[0009]将所述扩增液和所述纳米金检测探针溶液混合，反应完全后对混合液进行检测，完成所述DNA结合蛋白的检测。

[0010]在一个实施例中，所述提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液的操作为:

[0011]将HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，置于加湿处理的含有5% 二氧化碳的37°C培养箱中，加入20纳克每毫升TNF- α进行刺激，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞，收集细胞提取物即为所述待检测的DNA结合蛋白的样品溶液。

[0012]在一个实施例中，所述DNA结合蛋白为NF- K B ρ50蛋白。

[00]在一个实施例中，所述聚合酶为KF聚合酶，所述内切酶为Nb。BbvCI内切酶。

[0014]在一个实施例中，η=2、

[00]在一个实施例中，所述纳米金颗粒溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备得到。

[0016]在一个实施例中，对所述混合液进行检测的操作可以为:肉眼直接观察，混合液中的纳米金检测探针发生聚集，颜色由红色变为紫色。

[00]在一个实施例中，对所述混合液进行检测的操作可以为:采用分光光度计检测混合液，光谱采集范围为410nm?800nm,检测更大吸收峰。

[00]在一个实施例中，所述作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID N0.1所示的序列。

[00]在一个实施例中，所述扩增模板的序列为SEQ ID N0.2所示的序列；

[0020]所述检测探针的序列为SEQ ID N0.3所示的序列；

[0021]所述第二检测探针的序列为SEQ ID N0.4所示的序列。

[0022]这种DNA结合蛋白的检测方法，通过特异性互补的检测探针与扩增产物中的靶DNA结合，使得结合了检测探针和第二检测探针的纳米金颗粒发生聚集，导致混合液的颜色发生变化。与传统的DNA结合蛋白的检测方法相比，这种DNA结合蛋白的检测方法由于结合了扩增方法与纳米金比色法，灵敏度较高，实验现象简单直观。

【专利附图】

【附图说明】

[0023]图1为一实施方式的DNA结合蛋白的检测方法的流程图。

[0024]图2为DNA结合蛋白的检测方法的机理图。

[0025]图3为纳米金颗粒(AuNP)的透射电镜图。

[0026]图4为为非变性凝胶电泳分析等温指数扩增反应产物；泳道I表示存在8纳摩尔每升的NF- K B p50特异性探针和8纳摩尔每升的NF- κ B ρ50 ;泳道2表示存在8纳摩尔每升的NF- κ B ρ50特异性探针，不存在8纳摩尔每升的NF- κ B ρ50 ;泳道3表示合成的长度为24个碱基的寡核苷酸；泳道4表示DNA marker (分子质量参照)。

[0027]图5为NF-κ B p50蛋白与非特异性探针的结合后纳米金吸收光谱的变化；曲线a表示存在2纳摩尔NF- κΒ p50蛋白和2纳摩尔特异性探针；曲线b表示存在2纳摩尔NF-kB p50蛋白和2纳摩尔非特异性探针；曲线c表示存在2纳摩尔特异性探针，不存在蛋白。

[0028]图6为A700/A525的吸收峰比值随NF-κ B ρ50蛋白浓度变化的曲线。

[0029]图7为图6所示的曲线取对数后得到的Α700/Α525的吸收峰比值与NF-κ B ρ50蛋白浓度的指数线性图，线性关系从5皮摩尔到2000皮摩尔。

[0030]图8为凝胶迁移实验(EMSA)验证HeLa细胞核提取物中NF- κ B p50蛋白的活性；泳道1、存在10微克未经TNF- α诱导的细胞核提取物和4皮摩尔的NF- κ B探针；泳道2、存在10微克经TNF- α诱导的细胞核提取物，不存在NF- κ B探针；泳道3、存在10微克经TNF- α诱导的细胞核提取物和4皮摩尔的NF- κ B探针。

[0031]图9为存在2纳摩尔每升的NF-κ B探针和细胞核提取物时，纳米金的吸收光谱图；(a)TNF_a诱导过的细胞核提取物(25纳克每微升)；(b)TNF_a未诱导过的细胞核提取物(25纳克每微升)；(C)不存在细胞核提取物。

【具体实施方式】

[0032]下面结合附图及实施例对DNA结合蛋白的检测方法做进一步的解释说明。

[0033]如图1所示的一实施方式的DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤:

[0034]S10、提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在Exo III存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液。

[0035]提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液的操作为:

[0036]将HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，置于加湿处理的含有5% 二氧化碳的37°C培养箱中，加入20纳克每毫升TNF- α进行刺激，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞，收集细胞提取物即为待检测的DNA结合蛋白的样品溶液。

[0037]结合图2、蛋白与DNA的结合位点在正义链的5’端，蛋白与DNA序列结合以后，ExoIII对双链DNA分别从3’端到5’端进行酶切。由于蛋白的结合对DNA序列进行了保护作用，Exo III不能通过反义 链的3’端进行切割，因此反义链被保留下来从而作为下面的等温扩增的引物。

[0038]也就是说，未被Exo III切割的DNA的反义链作为引物被保留在消化液中。

[0039]本实施方式中，DNA结合蛋白为NF-κ B ρ50蛋白，作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID N0.1所示的序列。

[0040]SEQ ID N0.1 所示的序列中为:5' -TGT GGA ATT GCT CTC CCT ATA GTGAGT CGTAGTTCC MG GAA AGT CCC ATC Τ-3'，加粗的部分为蛋白结合位点，Exo III肯定不能切割，斜体后面ATC T几个碱基不确定会不会切掉，因为存在酶的一个空间位阻问题，但是无论这几个碱基切割与否，都不影响下面的扩增反应。

[0041 ] S20、将消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应，反应完全后得到扩增液。

[0042]扩增模板包括η段重复序列以及η-1段依次连接重复序列的连接序列，引物与重复序列特异性结合，连接序列包括内切酶的酶切位点，η为不小于2的整数，引物扩增后得到扩增模板的互补序列，扩增模板的互补序列被内切酶切割形成η段包含所述重复序列的靶 DNA。

[0043]在一个特殊的方式中，η=2、聚合酶为KF聚合酶，内切酶为Nb。BbvCI内切酶。

[0044]本实施方式中，扩增模板的序列为SEQ ID N0.2所示的序列，并且扩增模板的3 ^末端还带有一个起到修饰作用的磷酸基团。

[0045]S30、提供纳米金颗粒溶液，并将纳米金颗粒溶液与含有检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育，孵育完成后得到纳米金检测探针溶液。

[0046]纳米金颗粒溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备得到，具体如下:

[0047]将3.7mL质量浓度为1%的HAuCl4水溶液加入到90mL水中加热至沸，然后迅速加入9mL质量浓度为1%的柠檬酸钠水溶液，并持续沸腾分钟，溶液颜色迅速由浅黄色至无色、黑色，更后得到酒红色胶体溶液。

[0048]孵育完成后，检测探针与纳米金颗粒结合，检测探针以纳米金颗粒为核心，形成球状结构；同时，第二检测探针与纳米金颗粒结合，第二检测探针以纳米金颗粒为核心，形成球状结构。

[0049]结合图2、检测探针(probel)与靶DNA特异性互补，第二检测探针(probe2)与靶DNA特异性互补，从而检测探针和第二检测探针可以与靶DNA进行特异性结合。

[0050]本实施方式中，检测探针的序列为SEQ ID N0.3所示的序列，第二检测探针的序列为SEQ ID N0.4所示的序列。

[0051]其中，检测探针的5'末端连接有起到修饰作用的巯基(-SH)，第二检测探针的3'末端连接有起到修饰作用的巯基(-SH)。

[0052]S40、将扩增液和纳米金检测探针溶液混合，反应完全后对混合液进行检测，完成DNA结合蛋白的检测。

[0053]结合图2、检测探针(probel)与靶DNA特异性互补，第二检测探针(probe2)与靶DNA特异性互补，从而检测探针和第二检测探针可以与靶DNA进行特异性结合，靶DNA起到搭桥作用，更终使得分别结合了检测探针和第二检测探针的纳米金颗粒发生聚集，从而导致混合液的颜色由红色变为紫色，通过分光光度计可以检测发现，混合液在紫光吸收域达到更大吸收峰值。

[0054]对混合液进行检测的操作可以为:肉眼直接观察，混合液中的纳米金检测探针发生聚集，颜色由红色变为紫色。

[0055]或者，对混合液进行检测的操作可以为:采用分光光度计检测混合液，光谱采集范围为410nm?800nm,检测更大吸收峰。

[0056]这种DNA结合蛋白的检测方法，通过特异性互补的检测探针与扩增产物中的靶DNA结合，使得结合了检测探针和第二检测探针的纳米金颗粒发生聚集，导致混合液的颜色发生变化。与传统的DNA结合蛋白的检测方法相比，这种DNA结合蛋白的检测方法由于结合了扩增方法与纳米金比色法，灵敏度较高，实验现象简单直观。

[0057]以下为具体实施例。

[0058]实施例1

[0059]纳米金颗粒溶液的制备:利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备纳米金颗粒溶液。将

3.7mL质量浓度为1%的HAuCl4水溶液加入到90mL水中加热至沸，然后迅速加入9mL质量浓度为1%的柠檬酸钠水溶液，并持续沸腾分钟，溶液颜色迅速由浅黄色至无色、黑色，更后得到酒红色胶体溶液。

[0060]纳米金检测探针的制备:用两种不同的巯基修饰的寡核苷酸来修饰纳米金颗粒。

5.2纳摩尔的探针I (序列为SEQ ID N0.3所示的序列)和5.2纳摩尔的探针2 (序列为SEQID N0.4所示的序列)一起加在2.5毫升的纳米金溶液中，在温静置16小时后，逐滴加入

0.1摩尔每升的磷酸盐缓冲液(PH7.0)调节至终浓度为10毫摩尔每升，同时加入NaCl调节至浓度为0.1摩尔每升，温静置40小时。然后在4°C，12000转每分钟离心25分钟，弃掉上清，用I毫升含有0.1摩尔每升NaCl的10毫摩尔每升的磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗三遍。更后纳米金检测探针I和纳米金检测探针2储存在0.3摩尔每升NaCl，10毫摩尔每升磷酸盐缓冲液(PH7.0)中，并放在4°C保存。

[0061]待检测的DNA结合蛋白的样品的制备:HeLa细胞(人宫颈癌细胞系)在含有10%胎牛血清的DMEM (—种培养液)中培养，置于加湿处理的含有5% 二氧化碳的37°C培养箱中。HeLa细胞分为两组，一组加入20纳克每毫升TNF- α进行刺激，一组不加入TNF- α，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞(厂家ActiveMotif，货:10)，收集细胞提取物并且用Bradford法定量蛋白浓度，细胞提取物更终冻存于负80°C冰箱中备用。

[0062]DNA结合蛋白的消化:不同浓度的纯化的重组NF-κ B p50蛋白与2纳摩尔每升的双链DNA探针在7微升蛋白结合液中温下反应30分钟。蛋白结合液中含有10毫摩尔每升PH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，0.1毫克每毫升的酵母tRNA，10%甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇。细胞提取物与2纳摩尔每升的双链DNA探针在7微升蛋白结合液中温下反应30分钟。蛋白结合液中含有10毫摩尔每升pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，10%甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇，2毫摩尔每升pH值为7.0的磷酸钠，20纳克每微升HaeII1-CUt E。coli DNA, 25纳克每微升的酵母tRNA。蛋白与DNA孵育后与消化液混合至总体积为10微升，其中含有20个单位DNA外切酶III, 10毫摩尔每升Bis Tris Propane-HCl, 10毫摩尔每升氯化镁，I毫摩尔每升二硫苏糖醇，37V反应5分钟，700C 20分钟灭活，结束消化反应。由DNA外切酶III切割得到的作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID N0.1所示的序列。

[0063]靶DNA的扩增:扩增体系总共20微升体系，分为两部分，A液和B液。A液包括2微升的消化产物，0.05微摩尔每升模板(序列为SEQ ID N0.2所示的序列)，250微摩尔每升的脱氧核苷三磷酸混合液，IXNEB缓冲液2( 10毫摩尔每升三氨基甲烷盐酸，50毫摩尔每升的氯化钠，10毫摩尔每升的氯化镁，I毫摩尔每升二硫苏糖醇，pH值为7.9)。B液包括0.25单位每微升Nb。BbvCI内切酶，0.05单位每微升的KF聚合酶。A液95°C，3分钟，在40°C孵育5分钟。然后A液和B液立刻混合，在40°C反应40分钟。

[0064]纳米金比色反应:10微升扩增产物与微升纳米金检测探针I溶液和微升纳米金检测探针2溶液一起孵育。然后用含有0.3摩尔每升的氯化钠和10毫摩尔每升pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释至0微升，更后用紫外分光光度计检测混合液。光谱采集范围在410-800纳米，更终发现混合溶液的更大吸收峰在525纳米处。

[0065]结合图2、对反应机理进行简单描述:

[0066]双链DNA探针包括两条反向的互补配对的寡核苷酸序列，蛋白与DNA的结合位点在正义链的5’端。DNA外切酶III具有从3’端到5’端持续切割DNA双链的能力。当DNA与蛋白结合时，DNA外切酶III不能通过结合位点而继续切割，因此反义寡核苷酸链得以保存下来作为扩增反应的引物。扩增反应的模板包括两部分序列相同的X，中间被序列A分开。X序列与保留下来的反义链的3’端互补配对，序列A是Nb。BbvCI对双链DNA序列的识别位点。当扩增反应的模板，DNA聚合酶，内切酶和脱氧核苷三磷酸都存在时，保留下来的反义寡核苷酸链作为引物起始扩增反应，通过切割酶的作用产生新的引物序列。这些新的引物可以与其他的DNA模板结合，开始新的一轮聚合，切割，链取代反应，更终产生更多的单链DNA。这些单链DNA作为连接体，可以与纳米金探针结合(探针I和探针2都是检测探针，它们都与扩增产物中DNA结合，形成三位置杂交的形式，扩增产物中靶DNA与两个探针的结合，靶DNA起到搭桥作用，才使得探针I和2修饰的纳米金颗粒靠拢发生聚集)引起纳米金的聚合，颜色由红色变为紫色。这种颜色变化可以由肉眼直接观察到，并且可以通过紫外吸收光谱的测定进行定量从而实现对蛋白的检测。当没有蛋白与DNA序列结合时，双链DNA序列被DNA外切酶III切割，不能进行等温扩增，没有连接序列产生，因此不能使纳米金聚合，没有颜色发生变化。

[0067]实施例2

[0068]1、纳米金和DNA修饰的纳米金的特征

[0069]为了得到均匀大小的纳米金颗粒，通过扫描透射电镜观察合成的纳米金颗粒的粒径大约都为14纳米，几乎都呈圆形，具有良好的分散性，结果如图3所示。

[0070]2、基于扩增的纳米金比色检测NF-κ B p50可行性实验

[0071]为了确定基于扩增的纳米金比色是否可以检测DNA结合蛋白，我们选择NF-κ BP50转录因子作为模型进行检测。NF-κΒ p50与DNA结合，经过DNA外切酶III切割和40°C等温扩增后，首先通过14%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证是否有24nt的寡核苷酸序列产生。结果如图4中显示，NF-κ B p50存在时(电泳跑道I)可以产生24nt的寡核苷酸序列，NF- κ B p50不存在时(电泳跑道2)没有目的条带产生。

[0072]3、DNA结合蛋白特异性检测

[0073]为了证明该检测方法的特异性，我们进行了对照实验。结果如图5、为NF-κΒ p50蛋白与非特异性探针的结合后纳米金吸收光谱的变化。曲线a表示存在2纳摩尔NF-κ BP50蛋白和2纳摩尔特异性探针；曲线b表示存在2纳摩尔NF- κ B p50蛋白和2纳摩尔非特异性探针；曲线c表示存在2纳摩尔特异性探针，不存在蛋白。由图5可以看出，曲线a相对于曲线b明显其光吸收值向紫外方向发生了偏移。

[0074]4、DNA结合蛋白灵敏度检测

[0075]为了证明本技术方案检测DNA结合蛋白的灵敏度，我们对不同浓度的NF-κ B p50蛋白进行了检测分析。随着蛋白浓度的增加，纳米金颜色由红色变为紫色。同时，随着蛋白浓度的增加，525纳米处的吸收峰值逐渐降低，而700纳米处的吸收峰值逐渐增加。700纳米和525纳米处的吸收峰值的比值(A700/A525)用来分析纳米金颗粒的聚集程度，比值越高纳米金聚集程度越高呈现紫色，比值越低，纳米金呈分散状态，颜色为红色。图6和图7显示随着蛋白浓度的增加，A700/A525比值也增加，且浓度与A700/A525比值呈对数关系，即浓度的对数值与A700/A525呈线性关系，且线性关系覆盖3个数量级，由5皮摩尔每升到2纳摩尔每升。线性关系方程为A=-0.0316+0.27311oglOC，其中A表示A700/A525比值，C表示蛋白浓度(皮摩尔每升)。用此方程分析空白值加上3倍偏差值得到检测限为3.8皮摩尔每升。这种方法的检测灵敏度比直接用纳米金检测和用能量共振转移检测高出4个数量级。

[0076]5、实际样品的检测

[0077]为了证明此方法的可行性，我们进行了实际样品的检测。用TNF-α诱导人宫颈癌细胞系HeLa，使其产生大量NF-κ B p50、利用凝胶迁移实验(EMSA)证明细胞核提取物中的NF- κ B p50是否具有活性，结果如图8所示。TNF- α诱导的细胞核提取物组(电泳跑道3)有一条明显的NF-κ B Ρ50与双链DNA结合的条带，相反没有经过TNF-α诱导的细胞核提取物组(电泳跑道1)，NF-kB ρ50与双链DNA结合的条带非常弱。

[0078]图9显示的结果与EMSA实验一致，TNF- α诱导的细胞核提取物组，纳米金有明显的颜色变化，且更大吸收峰发生偏移(曲线a)，未经过TNF- α诱导的细胞核提取物组，纳米金没有明显的颜色变化，且更大吸收峰发生很小的偏移(曲线b)与没有细胞提取物的对照组(曲线c)结果基本一致。

[0079]以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

【权利要求】

1、一种DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤: 提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在Exo III存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液，其中，未被Exo III切割的DNA的反义链作为引物被保留在所述消化液中； 将所述消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应，反应完全后得到扩增液，其中，所述扩增模板包括η段重复序列以及η-1段依次连接所述重复序列的连接序列，所述引物与所述重复序列特异性结合，所述连接序列包括所述内切酶的酶切位点，η为不小于2的整数，所述引物扩增后得到所述扩增模版的互补序列，所述扩增模版的互补序列被所述内切酶切割形成η段包含所述重复序列的靶DNA ； 提供纳米金颗粒溶液，并将所述纳米金颗粒溶液与含有检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育，孵育完成后得到纳米金检测探针溶液，其中，所述检测探针与所述靶DNA特异性互补，所述第二检测探针与所述靶DNA特异性互补； 将所述扩增液和所述纳米金检测探针溶液混合，反应完全后对混合液进行检测，完成所述DNA结合蛋白的检测。

2、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液的操作为: 将HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，置于加湿处理的含有5% 二氧化碳的37°C培养箱中，加入20纳克每毫升TNF- α进行刺激，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞，收集细胞提取物即为所述待检测的DNA结合蛋白的样品溶液。

3、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述DNA结合蛋白为NF-κ B ρ50 蛋白。

4、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述聚合酶为KF聚合酶，所述内切酶为Nb。BbvCI内切酶。

5、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，η=2、

6、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述纳米金颗粒溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备得到。

7、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，对所述混合液进行检测的操作可以为:肉眼直接观察，混合液中的纳米金检测探针发生聚集，颜色由红色变为紫色。

8、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，对所述混合液进行检测的操作可以为:采用分光光度计检测混合液，光谱采集范围为410nm?800nm，检测更大吸收峰。

9、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID N0.1所示的序列。

10、根据权利要求1所述的DNA结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述扩增模板的序列为SEQ ID N0.2所示的序列； 所述检测探针的序列为SEQ ID N0.3所示的序列； 所述第二检测探针的序列为SEQ ID N0.4所示的序列。

【文档编】G01N33/68GK103472236SQ20104728

【公开日】20年12月25日 申请日期:20年9月11日 优先权日:20年9月11日

【发明者】张春阳, 张艳 申请人:深圳先进技术研究院

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