口碑排行榜TOP3实时榜单dna端粒长度检测

一、dna端粒延长

端粒长度检测（telomere）是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，是一段DNA序列与蛋白质形成的复合体，使正常染色体端部间不发生融合，保证每条染色体的完整性，控制细胞生长与分裂周期，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。人类的端粒重复序列DNA由重复排列的TTAGGG组成（见右图）。

正常人细胞在分裂过程中，DNA的复制不能够复制其更末端的一小段序列，导致细胞每次分裂后，DNA就会缩短一些，此即“染色体末端缩隐“。由于DNA末端有端粒序列的保护，DNA复制只损失了一部分端粒序列，而不会危及正常DNA序列。当细胞复制多次，端粒缩短到一定程度时，正常DNA序列会变得不稳定，此时，细胞也就开始走向衰老与死亡。研究表明，正常情况下，人体细胞在平均分裂复制50次左右后会因自产毒素而坏死，此即为“海夫利克极限”。

端粒长度检测是真核生物线性染色体末端的非编码串联重复性(TTAGGG)n阵列，端粒长度的变化，与衰老、癌症、或神经退行性等多种疾相关。定量PCR法是检测端粒长度的经典技术，用时短，操作简单，结果准确，适用于批量样本检测。

本产品试剂盒采用双色荧光 qPCR（SYRBgreen+VIC）检测端粒相对长度，检测对象为血液、口腔拭子或细胞DNA。该试剂盒具有以下特点。

1、 稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

2、 可靠：端粒与内参单管检测，减少孔间干扰。

内参基因为多拷贝，与端粒量差降低。

3、 方便：操作简单，无需电泳步骤。

4、 定量： △CT 值，可定量检测端粒相对长度。

端粒长度检测是一种相对简单的检测，不需要大量起始 DNA（约 50 ng）。通过测量端粒信 ( T ) 与参考单拷贝基因信 ( S )，计算T / S比率，该比率与平均 TL （Telomere Length，端粒长度）成正比，因此可用于确定相对 TL。由于该技术的性质可以应用于高通量检测，因此被广泛用于大规模人群研究。然而，由于 Q-PCR 仅提供相对定量，因此数据通常不会以kb形式的绝对端粒长度呈现，除非与具有由另一种方法确定的平均 TL 的参考细胞系进行比较。有研究显示此方法的测定结果的变异系数可能高于 10% 。而且，由于使用了不同的单拷贝基因，不同实验之间的结果可能存在很大差异。此外，Q-PCR 不提供有关更短端粒的信息。更后，用于 TL 测量的 Q-PCR 可能不适用于癌症研究，其中的内参单拷贝基因可能由于非整倍性而被复制或丢失。因此，Q-PCR 的适用性仅限于正常二倍体和核型稳定的样品。

端粒是在所有脊椎动物线性染色体末端的非编码串联重复性(TTAGGG)n序列。端粒的3'末端单链悬垂侵入双链 DNA，形成 T 环，这也导致链位移，产生单链端粒D-环。T 环是端粒的特殊结构，其与端粒保护蛋白Shelterin复合体直接或间接结合，保护染色体末端不被识别为 DNA 双链断裂。

端粒是真核细胞染色体末端由重复性的dna序列和特殊的端粒结合蛋白所组成的一段特殊结构，其中脊椎动物的端粒由富含g的短双链重复序列ttaggg串联组成。端粒能够防止染色体末端的降解、融合和重排，从而维持染色体的独立性、完整性和稳定性。虽然端粒不具备编码功能，却被科学家称为“生命的时钟”，因为端粒的长度和稳定性控制着细胞的寿命，并与细胞的癌变和衰老密切相关。

在正常人类体细胞中，端粒的长度会随着细胞分裂而逐渐缩短，细胞每分裂一次，端粒长度缩短一截，损失20～30个核苷酸，当端粒缩短到一定程度时，会诱导核蛋白结构的缺失，触发复制性衰老，出现细胞增殖减慢、生长停滞、干性减退、丧失分化能力等现象。同时，缩短的端粒上某些端粒特殊结合蛋白的丢失还会导致细胞将端粒末端错误识别为dna断裂位点，从而启动dna修复功能，导致短端粒染色体之间的末端融合，染色体的融合会造成细胞有丝分裂异常，细胞周期停滞，进而引发由p53蛋白诱导的细胞凋亡。

此外，p53等基因突变导致细胞周期检测点缺陷的细胞会跃过复制性衰老，持续分裂更终进入危机期，这个时期极少数细胞表达端粒酶，激活端粒酶活性，修复并维持细胞端粒长度，使得细胞永生化为癌细胞。在诸如直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等90％癌细胞中发现端粒过度缩短和端粒酶活性。端粒异常导致的疾还包括白血、再生障碍性贫血、骨髓增生异常和先天性角化不良等。端粒在人类的衰老与疾的发生进程中扮演着极其重要的角色，端粒重复序列的长度变化决定着细胞的命运，因此端粒长度检测是端粒生物学研究中的重要实验方法。

此外，端粒长度检测在衰老疾和肿瘤中也具有重要的诊断价值。由于种属差异，人类染色体的端粒长度(双链长度一般在0.5～20kb)远小于大多数实验模型生物；且不同个体不同细胞中的端粒缩短程度不一样，细胞内不同染色体的端粒缩短程度也不一样；而长度小于等于3kb的端粒被定义为短端粒，更短的端粒而非平均端粒长度在端粒功能丧失，诱发dna损伤和限制细胞存活中扮演重要角色。因此，亟需一种能够在单个染色体水平精确、简单、快速、高通量地检测人类端粒长度和短端粒比率的方法。

在端粒相关遗传疾的发展过程中，当端粒较短时会导致疾早发 。随着研究的不断深入，人们也越来越认识到生活方式因素，如肥胖、吸烟、缺乏运动和慢性压力等会影响循环外周血白细胞中的端粒长度。另外，导致端粒功能障碍的端粒缩短与许多年龄相关疾有关，如不孕症、关节炎、糖尿、癌症、心血管和神经退行性疾等。因此，可以预测这些疾发生的稳定且可重复的端粒长度测定方法是十分重要的。

然而，基本上所有已发表的端粒相关疾的大规模人群研究本质上都是相关性研究，只提供了端粒平均长度或相对端粒长度的信息。有大量证据表明，触发 DNA 损伤反应的是更短的端粒，从而导致哺乳动物的复制性衰老。更短端粒的长度是决定细胞命运和衰老开始的关键生物标志物，但可检测短端粒的方法却费时费力，不能实现高通量要求。故现有的端粒长度测定方法不分优劣，各有千秋。

端粒长度的异常改变或许在疾早期便会发生，端粒长度在几十年后可能会成为某些疾的早期查指标，甚至辅助诊断指标或者预后评估指标。简单易行的高通量检测方法可以用于大规模人群的流行学研究找到端粒相关疾，提供不同端粒长度分布的更精确的检测方法可以用于寻找端粒长度与相关疾之间的可能机制；当然，既高通量又精确又可提供多方面信息的端粒检测方法更应成为我们研究的目标。

二、端粒长度检测trf

QPCR 法检测端粒长度的基本过程可分为如下几步：

A。 基因组 DNA 的抽提，方法同 Southern 印迹法检测，测定浓度后，稀释到约 20 ng/μl 浓度。

B。 PCR 反应的设置，取模板 DNA 50～100 ng，分别加入以下端粒引物对（T 反应引物）以及对照单拷贝基因 36b4 引物对（S 反应引物）构成的 PCR 体系中，PCR 反应的条件为：PCR 活化反应 95 ℃ 10 min 以激活体系内的 Hot StarTaq DNA 聚合酶，然后进行两步循环法，T 反应的条件为 95 ℃ 变性 s，54 ℃ 退火／延伸混合 2 min，共 个循环。S 反应的条件为 95 ℃ 变性 s，58 ℃ 退火／延伸混合 1 min，共 30 个循环。

C。 T/S 比率的计算，采用荧光定量 PCR 仪配套软件，分别确定 T 反应及 S 反应的 Ct 值-Ct（telomeres）及 Ct（36b4），根据 PCR 反应产物以 2 的指数倍递增原理，T/S 比率应该接近于公式［2C（telomeres）／2C:（36b4）］-1＝2-Δ。

此时，如果需要比较两个不同来源的细胞端粒长度的差异，则可以用 2-（ΔCt1-ΔC12）＝2-4ΔC 来进行计算。

三、dna 端粒

本文介绍了端粒长度检测的方法，包括端粒长度的测定的所需仪器及试剂，和实验步骤。

一、试剂耗材

试剂耗材

琼脂糖

5×loading buffer

DIG-labeled molecular marker

DIG Easy Hyb

Telomere probe

Hinf I 与 Rsa I

Antibody Solution

脱嘌呤液

变性液

中和液

20×SSC

2×SSC

低严谨性洗脱液（洗膜液I）

高严谨性洗脱液（洗膜液II）

马来酸缓冲液

Washing Buffer

Blocking Solution

Detection Buffer

带正电荷的尼龙膜

双圈定性滤纸

普通滤纸

平板纸

塑料托盘

玻璃棒

二、仪器

仪器

电泳槽

全温培养摇床

切纸机

移液器

自封袋

封口机

水浴锅

台式微量高速离心机

移液器

100孔离心管盒

X射线摄影暗匣

三、实验材料

以人类基因组DNA和对照DNA为例

限制酶：Hinf I和 Rsa I

四、实验方法

1、基因组酶切

①样品准备：取人类基因组DNAμL，加入2μL酶切缓冲液（10X）、0.5μL Hinf I和0.5μL Rsa I，总体系20μL

取对照DNAμL，加入2μL无核酶水，然后加入2μL酶切缓冲液（10X）、0.5μL Hinf I和0.5μL Rsa I,总体系20μL DIG 标记marker：marker 4μL+4μL 5×loading buffer +12μL无核酶水。

②.37℃水浴2h，分别加入5μL 5×loading buffer 终止反应。

③。电泳准备：配制1×TAE缓冲液；配制0.8%的琼脂糖凝胶。

④。电泳:将样品点入相应泳道，70V电泳3h。

2、变性

①。将100孔离心管盒的底座（下简称为盒）、玻璃棒、塑料托盘清洗干净，纯水冲洗，倒置晾干。

②。终止电泳，小心将凝胶取出，置于盒中，加入约0 ml的脱嘌呤液，放入37 °C摇床中，40 rpm, 10 min。

③。倒掉脱嘌呤液，100ml ddH2O冲洗2遍。

④。加入约0mL变性液，放入37℃摇床中，40rpm，min。

⑤。倒掉变性液，重复步骤。

⑥。倒掉变性液，100ml ddH2O冲洗2遍。

⑦。加入约0mL中和液，放入37℃摇床中，40rpm，min。

⑧。倒掉中和液，重复步骤。

⑨。倒掉中和液，加入约0mL 20×SSC，浸泡10min。

3、转膜

①。用切纸机将尼龙膜及双圈定性滤纸切成100×100mm；将普通滤纸切成0×260mm，将平板纸大致切割成0mm×1mm。

②。盒子倒扣于塑料托盘中，将0×260mm滤纸置于盒上，倒入少量20×SSC浸湿滤纸，小心用玻璃棒

③。小心将浸泡过的凝胶置于滤纸上，用玻璃棒赶走多余气泡。

④。将尼龙膜直接置于凝胶上，用玻璃棒赶走多余气泡。

⑤。用废旧的胶片封好四周，注意不要压住核酸域。

⑥。将一摞（约cm）平板纸置于滤纸上，小心盖上一本说明书。

⑦。在托盘中加入约500ml 20×SSC，过夜静置、转膜。

⑧。次日早晨，丢弃底部潮湿的平板纸，更换为新的平板纸，继续转膜2-3h。

4、固定

①。取走上的重物、平板纸、废旧胶片及滤纸，小心用铅笔在尼龙膜上的右下角做好标记，用镊子夹住尼龙膜的一角，核酸面向上将其放入盛有约100ml 2×SSC的溶液中，浸泡10min，去除多余盐分。

②。用酒精棉球擦拭凝胶成像仪的玻璃板，并自然风干。

③。将尼龙膜的核酸面向下，置于凝胶成像仪中，打开紫外灯，紫外照射固定min，固定结束。

5、预杂交

①。取10ml DIG Easy Hyb，37℃预热。

②。固定好的尼龙膜，核酸面向上置于自封袋中，将预热好的DIG Easy Hyb倒入自封袋中，赶走气泡封口，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应3h。

6、杂交

①。吸取适量的探针（使探针终浓度约25ng/ml）置于50μL PCR管中，100℃沸水反应5min。

②。迅速置于冰上冷却3min，瞬离。将探针加入预热的10ml的预杂交液中。

③。打开自封袋取出膜，放到新的自封袋中，迅速加入杂交液，赶走气泡封口，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应过夜。

7、化学发光

①。在100孔离心管盒的底座（下简称为盒）中倒入200ml 37℃预热的低严谨性洗脱液，取出尼龙膜，核酸面向上，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

②。尽弃低严谨性洗脱液，再加入200ml 37℃预热的低严谨性洗脱液，核酸面向上，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

③。尽弃洗脱液，加入200ml 65℃预热的高严谨性洗脱液，核酸面向上，置于65℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

④。将尼龙膜放入有100ml Washing Buffer的盒中，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm 反应5min。

⑤。倒掉Washing Buffer，加入100ml Blocking Buffer，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应1h。

⑥。倒掉Blocking Buffer，加入20ml Antibody Solution，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应30min。

⑦。倒掉Antibody Solution，加入100ml Washing Buffer，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应min。⑧。倒掉Washing Buffer，加入100ml Detection Buffer,置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

⑨。尼龙膜核酸面向上置于保鲜膜上，均匀滴加1ml CSPD，迅速覆盖上保鲜膜，温反应5min（注意不要让膜干掉）

⑩压片1h，显影、定影、记录结果，根据信强度，调整压片时间，直到获得满意的曝光结果。

四、端粒dna延长的机制

资源描述：

端粒长度检测方法 实时荧光定量PCR分两局部进行，分别测定端粒和内参基因RPLPO （核糖体大亚基P0 蛋白基因）的Ct值，每次反响需要设定标准曲线。端粒（T）重复拷贝数与单拷贝基因（S） 的比率，即T/S比率可以得出端粒的相对长度，而T/S比率与端粒长度成正比关系。T/S计 算公式如下 copy gene]2-ACT T/S二[2CTtelomeres/2CTsingle1基因组DNA的提取 1、提取人外周血基因组DNA 以试剂盒提取获得人外周血基因组DNAo2实时荧光定量PCR测定DNA端粒长度 1 。引物序列 端粒 Tel 1浓度 675 nmol/L序歹U 5 -GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3, 端粒 Tel 2浓度 50 nmol/L序歹U 5 -TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3、 RPLPO 基因 hRPLPOl浓度 800 nmol/L序歹U5 -CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA -3, RPLPO 基因 hRPLP02浓度 800 nmol/L序歹U 5 -CAGCAAGTGG-GAAGGTGTAATCC -3 2 。标准曲线制作 选取同一血样基因组DNA为标准品，使用等比稀释，稀释系数为2,浓度范围为 0.25-64ng/ul,即可稀释得9个浓度梯度,分别为64,32,16,8,421,050.25 ng/H I,制作 的标准曲线R20.98o。反响体系每个样设置品三个重复 10 U I反响体系 gDNA10ngMaster Mix quantiTect SyberGreen PCR kitUp to 10 U I 注内参及样品反响体系中，Master Mix除了引物不同外，其余成分均相同另一文献所述的反响体系 25 U I反响体系 SYBR Premix Ex Taq 2X12.5 u IgDNA1.0 U I 约 60ng/ u I 端粒 Tell 内参基因 hRPLPOl0.625 H I 1 U I 端粒 Tel 2 内参基因 hRPLP025 U I luldH2OUpto 25 U I 4、 PCR反响条件 95℃ 10 min 95 ℃ sec 54℃ 2 min 54c检测荧光强度，35个循环 72 ℃ lOmin参考文献 [l]Sonia Garcf a-Calzon, Adriana Moleres, Ascensio n Marcos et al。 Telomere Length as a Biomarker for Adiposity Changesafter a Multidisciplinary Intervention in Overweight/ Obese Adolescents The EVAS YON Study⑵吕昆，林丹，许淼等,应用实时荧光定量PCR测定牛体细胞端粒长度 ⑶王敏敏，杨浩，文IJ广义等。荧光定量PCR测定端粒长度

以上关于“dna端粒长度检测”的全部内容了，想要了解更多亲子鉴定相关资讯，请继续关注成之嘉生物。