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一、亲子鉴定规范20

SNP分型与应用规范

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SNP分型与应用规范-SF/Z JD0105003-20（20年11月20日发布实施）

1 范围

本技术规范规定了法庭科学 DNA实验用微测序法进行 SNP分型的要求及结果判断标准（采用微测序法作为 SNP分型技术的说明见附录 A）。

本技术规范适用于法庭科学采用 SNP进行个体识别和亲缘关系鉴定两个领域。

2 规范性引用文件

下列文件对于本技术规范的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本技术规范。凡是不注日期的引用文件，其更新版本（包括所有的修改单）适用于本技术规范。

GA/T 382－2014 法庭科学DNA实验建设规范

GA/T 383－2014 法庭科学DNA实验检验规范

GA/T 965－2011 法庭科学DNA亲子鉴定规范

CNAS－CL08：20 鉴定/法庭科学机构能力认可准则

CNAS－CL28：2014鉴定/法庭科学机构能力认可准则在 DNA鉴定领域的应用说明

SF/Z JD0105001－2010 亲权鉴定技术规范

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本技术规范。

3.1

单苷酸多态性 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）

指人群成之嘉常个体基因组的单个碱基的变异，且更小等位基因频率大于 1％。

微测序法 minisequencing technique

指基于引物延伸原理进行单个碱基序列分析的技术，也称引物延伸法。基本原理是在紧邻已知 SNP位点的上游设计引物，在仅有 ddNTP存在条件下进行测序反应时，延伸反应在延长一个碱基时终止，然后通过检测 ddNTP标记物的特征确定延伸单个碱基的种类。

3.3 SNaPshot方法 SNaPshot assay

是一种基于荧光标记 ddNTP单碱基延伸原理用于 SNP分型的微测序技术。同一反应体系中若含有针对不同 SNP的等位基因特异性引物，而它们 5’端长度不同，则可实现多个 SNP同步分析。

3.4 匹配概率 probability of matching（Pm）

指一名与案件没有关系的随机个体纯粹由于机会与检材分型结果一致的概率。

3.5 似然率 likelihood（LR）

是评估遗传分析提供证据强度的指标。数值上似然率是两个条件概率的比值。在个人识别时两个条件概率的设分别是，现场检材是嫌疑人所留（原告设）和现场检材是一个与案件无关的随机个体所留（被告设）。似然率提供了基于术语“支持”的简单约定,以便根据一定数据来支持一种设，排斥另一种设。

4 检验程序

4.1检材的提取和保存按照 GA/T383－2014中的要求进行。

4.2 DNA提取与定量分析按照 GA/T 383－2014中的要求进行。

4.3 SNP分型

4.3.1 采用基于微测序的 SNaPshot方法进行 SNP分型。分型方法包括： PCR扩增、引物延伸反应和电泳分型。

4. PCR扩增

4..1 PCR扩增试剂、仪器、反应体系及循环参数：按照 GA/T383－2014中的要求进行。

4.3. 在学领域应用 SNP进行个人识别和亲缘关系鉴定时，本规范建议可在以下 SNP中选择：

a)【常染色体 SNP】

1) 二等位 SNP：

rs740910、rs14904、rs35873、rs79255、rs1493232、rs2040411、rs28460、rs7302、 rs2534、rs8037429、rs8900、rs9098、rs8736、rs964681、rs737681、rs1463729、 rs60288、rs82387、rs14212、rs2056277、rs2107612、rs10250、rs1005533、rs7292、 rs10495407、rs576、rs7366、rs10325、rs733164、rs938283、rs210、rs86510、 rs914165、rs354439、rs763869、rs2076848、rs1024116、rs55366、rs7355、rs1454361、 rs727811、rs91、rs28300、rs907100、rs1029047、rs2046361、rs722098、rs876724、 rs2016276、rs826472、rs2830795、rs1028528、

2) 三等位 SNP：

rs1630312、rs3091244、rs2069945、rs6001030、rs140676、rs356167、rs941454、rs10045、 rs3743842、 rs2298556、 rs3816662、 rs2307223、 rs108197、 rs287498、 rs385780、

rs11141033、rs4555、rs3812847、rs2032582、rs2278786、

b)【非常染色体 SNP】

1) Y染色体 SNP：

rs96433、M145、rs9306845、rs9786479、rs276358、rs2075640、M4、M88、M95、 rs16980426、rs323322、M122、rs447354、M89、rs9786707、M、rs16980711、M9、 rs316592、rs276345、

2) X染色体：

rs2056688、rs21285、rs34285、rs763056、rs73592、rs993010、rs57054、rs1243792、 rs9258、rs1207480、rs363、rs777、rs72687、rs57602、rs985425、rs9333、 rs20288、rs961、rs31662、rs149910、rs73704、rs407、rs30674、rs39597、 rs81452、

3) 线粒体 SNP：

709、、36、3010、3394、3970、4216、4883、5147、54、5460、6392、6455、 8584、8701、9090、10397、10398、114、12705、708、928、143、14783、487、 165、

注:在上述 SNP基础上可增加文献报道且经验证的其它 SNP，以提高检测的系统效能。

4.3.3引物延伸反应扩增产物使用酸外切酶（Exo）和虾碱性磷酸酶 (SAP)进行纯化。在 Exo和 SAP酶处理后的PCR产物中加入SNP的单碱基延伸引物、 SNaPshot mix进行单碱基引物延伸反应，反应完成后，通过向产物中加入 SAP来消化未结合的荧光素标记的 ddNTP。

4.3.4电泳分型使用遗传分析仪，对 PCR产物进行毛细管电泳分析，数据分析可使用为观测峰的颜色和片段长度范围涉及的 Genotyper或 GeneMapper ID等软件进行

SNP分型。具体步骤按照仪器或软件操作手册进行。

5 SNP分型结果分析

5.1分型结果的说明

5.1.1 峰的位置与 SNP遗传标记 5’端加尾的长度有关，表示相互别的不同位点。纯合子以单峰形式出现，杂合子通常以不同颜色峰显示。

5. 峰的颜色表示所选择的SNP的苷酸信息，四种脱氧糖苷酸标记不同颜色的染料： A(绿色), G(蓝色), C(黄色，为了达到更好的视觉效果，通常显示为黑色), T(红色)。因此，在电泳图谱中出现一个绿色峰，表明一个 A（ddATP）通过聚合酶结合在 SNP上。

5.2分型结果的基本要求

5.2.1确认内标峰高阈值大于 100相对荧光单位，且每一内标峰标定正确。

5.确认已知阳性参照物的分型结果正确，阴性参照物无等位基因峰。

5.2.3样本分型图谱清晰，且峰高大于 100相对荧光单位。

5.3拔起峰的分析

5.3.1拔起峰（pull up峰）指含有荧光染料的单碱基延伸反应产物从一个光谱通道扩散到另一个通道的结果在电泳图谱中的呈现。

5.每一种荧光染料都有不同波长的更大发射光谱，而当某一荧光染料过多造成 matrix去颜色叠加不能正常工作，会出现拔起峰的现象

5.3.3当一个样本的 SNP分型图谱中，与主峰处于同一纵轴线的其他所有颜色上均有相应的吸收峰时，判断为拔起峰，通常由于超高峰所致。

5.3.4拔起峰可通过减少扩增时的样本 DNA量、减少扩增循环数、减少单碱基延伸反应产物、重建光谱校正等来消除。

5.4等位基因丢失的分析

5.4.1当 PCR扩增或单碱基延伸反应的模板在引物结合发生突变，阻碍引物结合，会导致扩增失败或引物延伸失败，无法检测到模板 DNA中本身存在的一个等位基因。

5.4.3考虑有等位基因丢失可能时，需更换 DNA序列不同的引物进行重新检测。

5.5非特异峰的分析

5.5.1 PCR引物去除不全：表现为在电泳图谱上出现的片段长度为比 PCR引物长度多 1个碱基的产物，为 Exo酶对 PCR引物消化不全，可加大 Exo酶量消化后去除。

5.5.2 ddNTP去除不全：未经消化的 ddNTP常出现在大于70bp的位置，超量的ddNTP也会出现在较短片段位置，为SAP对未结合的荧光素标记的 ddNTP消化不完全所致，可通过加大 SAP量消化后去除，由于 ddNTP是荧光素标记的，该原因导致的额外峰也称为染料峰。

5.5.3荧光污染：由于抗菌素、维生素、多环芳香族化合物、荧光助色物质、各种纺织染料等有荧光，导致出现非特异峰也称荧光污染峰，通常比较宽，拥有较宽的荧光光谱范围，可通过有机提取法去除。

5.5.4其它：还有由气泡、尿素结晶或电压波动引起的非特异峰称为伪峰，通常尖耸且出现在四种颜色的相同位置，没有重复性。

6 SNP分型结果表示

分型结果的描述： SNP检验结果以表格的形式列出，标明检材或样本的编、 SNP名称及等位基因分型。等位基因以 A、C、G、T表示，等位基因间以“/”分隔；纯合子只标出

1个；未得到分型或无法明确判定分型的标为“-”。

7 SNP分型结果应用

7.1补充个人识别鉴定 STR基因座被广泛应用于 DNA数据库建立和实际案件鉴定的个体识别。当犯罪现场提取的为降解检材时， SNP分型结果可作为补充鉴定应用于个体识别，即通过比较案发现场收集到的检材与嫌疑人的 SNP遗传标记，判断前后两次或多次出现的个体是否为同一个体。若两份检材的 SNP分型不同，可判断两份检材不是来自同一个体；若 SNP分型相同，则称为两份检材的 SNP分型匹配，即不能排除两份检材来自同一个体。

7.2 辅助亲缘关系鉴定当 STR系统的分型结果不足以确定某些复杂亲缘关系时， SNP可以作为补充鉴定的遗传标记。常染色体 SNP符合孟德尔遗传规律，即子代的等位基因一个来自于父亲，一个来自于母亲。在有争议的父母和孩子三份样本所检测的多个 SNP分型结果中，孩子的一对等位基因分别在有争议父母的基因型中找到来源时，不排除该有争议父母为孩子的生物学父母。 Y染色体、X染色体和线粒体SNP可在某些特殊的亲缘关系鉴定中作为补充鉴定的遗传标记使用。

8 SNP分型结果评估

8.1个人识别

8.1.1 匹配。两份检材所检测的多个 SNP均相同时判断为匹配。两份检材遗传标记分型匹配有两种可能的原因：①两份检材来自同一个体；②两份检材不是来自同一个体，理论上可能来自群体中的一名随机个体，仅仅因其遗传标记碰巧相同而出现了匹配。此时可以通过计算匹配概率来估计一个理论上的随机个体碰巧匹配的可能性有多大。匹配概率按附录 B计算，似然率按附录 C计算。

8. 不匹配。在排除拔起峰、等位基因丢失、非特异峰等前提下，两份检材在所检测的 SNP中有两个及以上不同时判断为不匹配。

8.1.3 两份检材在所检测的 SNP中只有一个不同时，不能排除两份检材来自同一个体，需增加检测更多 SNP。增加检测更多 SNP后，两份检材在所检测的 SNP中有两个及以上不同时判断为不匹配。

8.2 亲子鉴定

SNP作为亲子鉴定的补充遗传标记。累积非父排除概率和累积父权指数按 GA/T 965－2011或 SF/Z JD0105001－2010中的要求计算。对于不符合遗传规律的 SNP，PI取值可为 0.00001、

8.3 SNP与 STR的同时使用

当 SNP与 STR同时使用时，或多个 SNP同时使用时，需有证据表明 SNP与 STR是相互独立的，或 SNP之间是相互独立的。不能证明相互独立时按单倍型计算。

我要:

二、亲子鉴定规范

这几年，随着医学技术及时代的发展，亲子鉴定逐渐被更多的人知道，通过鉴定来判断孩子是不是自己亲生的委托人越来越多。从传统的产后亲子鉴定，发展到现在的无处胎儿亲子鉴定，DNA亲子鉴定技术也从STR分型发展到SNP分型。那么STR分型与SNP分型有什么别呢？

首先从DNA亲子鉴定的发展来讲，亲子鉴定从诞生到现在共经历了三个发展阶段：

个阶段是血型鉴定阶段，传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血清型和红细胞酶型等方式，通过A、B、O三种基因型和A、B、AB和O型四种表现型之间的因果关联，来分析子女与父母之间的亲子关系。但由于血型中遗传标志均为基因编码的产物，多态信息含量（PIC）太少，不能反映DNA编码的多态性，而且遗传标志存在生理性、理性变异（如A型、O型血的人受大肠杆菌感染后，B抗原可能呈阳性这样的情况，因此容易失活导致检验结果不准确，不足以精准判定亲权关系；

第二个阶段是STR(Short tandem repeats)又称SSR阶段，即短串联重复序列，又称微卫星DNA（micro satellite DNA），以串联的短序列重复为标志,在不同的生物中串联的重复次数不同，表现为个体1、ATATATATAT 个体2、ATATATATATATATAT，利用少量的STR位点就可以计算亲权系数，位点越多，计算越精准，一般采用16或者21个位点来参与计算。该技术虽然目前还被广泛应用，但亲子鉴定中常会发生STR突变的情况，突变对亲子关系的判定会造成困扰；

个阶段是SNP（单个位点的苷酸突变）阶段，又称单苷酸多态性鉴定技术，表现为个体1、ATCTGG个体2、ATGTGG，是更新诞生的一种亲子鉴定技术，结合新一代测序技术，可以通过大量SNP基因位点的计算来精准判定亲属关系。单苷酸多态性(SNP)作为代遗传标记，在遗传制图、连锁性分析、疾基因定位和物种多态性研究等诸多领域中，SNP已经逐渐取代STR，成为首选的遗传标记。

DNA亲子鉴定STR分型与SNP分型别：

通过上面对DNA亲子鉴定的发展的介绍，大家对STR分型与SNP分型有一定的了解，下面我就来一下，STR广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。它由2~6碱基对构成心序列,呈串联重复排列，STR基因位点长度一般在100～300 bp之间，因个体间DNA片断长度或DNA序列差异而成高度多态性,在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传；SNP是在基因组水平上由单个苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性。这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP是人类可遗传的变异中更常见的一种，也是基因组中更为稳定的变异，占所有已知多态性的90％以上。任何一个群体中频率不低于1％的SNP位点大约有1000万个，占总的SNP位点的90％。SNP更大限度地代表了不同个体之间的遗传差异。

１、作为遗传标记，SNP比STR更为稳定，STR序列的突变率高于人类基因的平均突变率，而且STR中存在着多个心序列重复、心序列的非整倍重复等现象，SNP则不存在这类问题；

２、SNP检测比STR检测对DNA样本的要求更低，适应更多的特殊环境，SNP是单碱基图片，在PCR过程中一般只需扩增1OObp左右的长度即可完成检测，如在极端温度与湿度的影响下，DNA会降解，很难收集到足够的STR数据，象9.11灾难很多遇难人员身份识别用STR没办法确认，就是通过SNP实现的；

３、相对于STR，SNP的检测样本成本更低，且通量更高；

４、在父母与子女之间的亲缘关系鉴定方面，十几个位点的STR鉴定系统能够提供充分的信息，但当鉴定的需求扩充到更远的亲缘关系，如表亲的样本鉴定时，STR位点鉴定提供的信息则不足以支撑鉴定结果，而SNP位点由于具有远超过STR位点的数量，可以提供更多的信息，理论上能够对很远的亲属关系也提供可信的判定；

简单来说STR分型比SNP分型对样本要求高，相对应的样本信息含量也高，STR遗传标记是重复序列为2-5个苷酸，含有多个等位基因，SNP遗传标记多数为二等位基因，碱基替换或颠换，这就是为什么SNP更稳定，对样本要求低且检测成本低的原因；STR遗传标记可复合扩增-20个位点，SNP遗传标记复合扩增50个以上的位点，这也是为什么SNP能够对表亲这样的亲属关系进行鉴定。

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