焦点关注导读甲基化检测方法

一、DNA甲基化检测方法

基因甲基化检测⽅法有哪些

探究了宫颈细胞变化与基因甲基化的关系过后，我们要做的就是如何检测出基因甲基化的存在

现象。随着科学技术的发展，检验技术也在部断提升。⼤致可以分为两类：特异位点的甲基化

检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析

(methylation profiling)

。下⾯敬善基

因来为⼤家介绍⼀些常⽤的⽅法。

甲基化特异性

PCR(MS-PCR)

这种⽅法经济实⽤，⽆需特殊仪器，因此是⽬前应⽤更为⼴泛的⽅法。在亚硫酸氢盐处理后，

即可开展

MS-PCR

。在传统的

MSP

⽅法中，通常设计两对引物，⼀对

MSP

引物扩增经亚硫酸氢

盐处理后的

DNA

模板，⽽另⼀对扩增未甲基化⽚段。若第⼀对引物能扩增出⽚段，则说明该检

测位点存在甲基化，若第⼆对引物能扩增出⽚段，则说明该检测位点不存在甲基化。

这种⽅法灵敏度⾼，可⽤于⽯蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在⼀定的缺陷，你

要预先知道待测⽚段的

DNA

序列，并设计出好的引物，这⾄关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐

处理不完全的情况，那可能导致阳性。

亚硫酸氢盐处理

+

测序

这种⽅法⼀度被认为是

DNA

甲基化分析的⾦标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，⽤

PCR

扩增⽬的⽚段，并对

PCR

产物进⾏测序，将序列与未经处理的序列进⾏⽐较，判断

CpG

位

点是否发⽣甲基化。这种⽅法可靠，且精确度⾼，能明确⽬的⽚段中每⼀个

CpG

位点的甲基化

状态，但需要⼤量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。

联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法

(COBRA)

DNA

样本经亚硫酸氢盐处理后，利⽤

PCR

扩增。扩增产物纯化后⽤限制性内切酶

(BstUI)

消化。

若其识别序列中的

C

发⽣完全甲基化

(5mCG5mCG)

，则

PCR

扩增后保留为

CGCG

，

BstU I

能够

识别并进⾏切割；若待测序列中，

C

未发⽣甲基化，则

PCR

后转变为

TGTG

，

BstUI

识别位点丢

失，不能进⾏切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲

基化的⽐例。

这种⽅法相对简单，可快速定量⼏个已知

CpG

位点的甲基化，且需要的样本量少。然⽽，它只

能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品

DNA

中存在甲基化的可能。

荧光定量法

(Methylight)

此种⽅法利⽤

TaqMan

探针和

PCR

引物来分甲基化和未甲基化的

DNA

。⾸先⽤亚硫酸氢盐处

理

DNA

⽚段，并设计⼀个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量

PCR

。这种⽅法更⼤的

优势在于其⾼通量和⾼敏感性，且⽆需在

PCR

后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。

甲基化敏感性⾼分辨率熔解曲线分析

亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化

DNA

会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来

发现，因为甲基化

DNA

含有更多的

GC

，相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的变化，可轻易

分完全甲基化、完全⾮甲基化或杂合甲基化。⾼分辨率熔解

(HRM)

技术可检出极微⼩的差别。

使⽤这种⽅法进⾏甲基化分析仅需⼀对引物，相⽐以往的⽅法更加快捷、简便和精确。不过对

仪器的要求颇⾼，需要带

HRM

模块的荧光定量

PCR

仪。

焦磷酸测序

焦磷酸测序技术

(Pyrosequencing)

作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，

对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。

通过准确定量单个连续的

CpG

位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本⾝能检测并定量甲基化⽔平

上的细微改变。在序列延伸过程中，根据

C

和

T

的掺⼊量来定量确定单个位点的

C-T

⽐例。因

此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化

状态也就以序列形式呈现。

基于芯⽚的甲基化图谱分析

就甲基化图谱分析⽽⾔，⽬前流⾏的分析⽅法是芯⽚。

二、甲基化检测方法比较

今天普拉特泽生物带大家学习的是DNA甲基化检测的六种方法及各自的优势，文尾附有视频教程供大家学习~理论知识不够熟练的同学请全文背诵。普拉特泽生物表达检测平台专注承接DNA甲基化检测代做服务，本文根据我们承接的多例DNA甲基化代测实验，出六种我们常用的适用于不同DNA甲基化研究方向的解决方案，供大家参考学习：

1、全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

l应用范围广：适用于人和大多数动植物研究（参考基因组已知）

l全基因组覆盖：更大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱

l单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态

2、精准DNA甲基化和羟甲基化测序（oxBS-seq）

DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化“金标准”的重亚硫酸盐测序并不能分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。易基因联合剑桥建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。

lDNA甲基化检测全新的“金标准”

l全基因组单碱基检测DNA羟甲基化修饰

l多重标准验证高氧化效率和高Bisulfite转换率

l实验偏好性低，重复性高（R²>0.98）

l可满足多种测序应用需求：简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS），目标域氧化甲基化测序（Target-oxBS）

3、简化甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS）

简化甲基化测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS）是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG域的测序深度，在CpG岛、启动子域和增强子元件域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。为了适应科研技术的需要，我们进一步开发了可在更大域内捕获CpG位点的双酶切RRBS（dRRBS），可研究更广泛域的甲基化，包括CGI shore等域。

l精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。

l重复性好：多样本的覆盖域重复性可达到85%-95%，适用于多样本间的差异分析。

l性价比高：测序域针对高CpG域，数据利用率更高。

4、单/微量细胞全基因组甲基化测序（scWGBS）

单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。

l超低起始量：单细胞或超低的建库DNA起始量

l测序覆盖度高 ：更大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱

l单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态

5、扩增子（羟）甲基化测序

扩增子（羟）甲基化技术针对基因组上特定的DNA序列设计甲基化特异性扩增引物（如感兴趣的基因等），基因组DNA进行（氧化）重亚硫酸盐处理后，PCR扩增检测片段，扩增产物通过二代高通量测序，更精准的检测基因域的甲基化状态。

技术优势

l准确性高：可满足几个到上百个基因/CpG 位点的检测，其覆盖范围内可达到单碱基分辨率，覆盖深度超高（位点平均覆盖深度>300X）。

l性价比高：低成本、周期短，超高性价比。

l针对性强：适用于特定基因或者位点甲基化状态的检测。

l应用广泛：广泛用于临床样本多位点的甲基化 Biomarker 选、验证及临床转化应用。

6、（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序(h)MeDIP-seq

5hmC是新发现的一种的修饰碱基，由TET家族的酶通过氧化5mC产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域（MBD）与甲基化DNA的亲和性，具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能，而且参与了DNA去甲基化过程。

l检测范围广：全基因组范围鉴定甲基化修饰域

l针对性强：针对性检测基因组内具有甲基化修饰的域

l成本低：大大降低了测序数据量，测序成本低

那么关于DNA甲基化检测的六种实验方案我们就到这里啦，还有想要学习DNA甲基化检测的同学可以点击甲基化检测 理论+实操进行更深入的学习~本文就到这里啦，再见！

三、甲基化检测方法有哪些

一、甲基化分型

绝大多数的DNA甲基化分型均基于聚合酶链反应(PCR)的方法 , 使用亚硫酸氢钠处理过的DNA作为模板。PCR引物设计上通常存在2种策略:甲基化非依赖性PCR(methylation-independent PCR, MIP)引物:甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MSP)引物。

1、 亚硫酸氢钠处理 DNA聚合酶无法分甲基化及非甲基化的胞嘧啶, 故普通PCR过程会导致表观遗传学信息的丢失。92年Frommer等[首次报道了基于亚硫酸氢钠处理的方法, 并被广泛使用, 成为PCR法检测单位点DNA甲基化的重要基础。经亚硫酸氢钠处理后胞嘧啶可转化为尿嘧啶, 而甲基化后的5-甲基胞嘧啶脱氨基转化为胸腺嘧啶的几率大大降低。由此亚硫酸氢钠处理后胞嘧啶只来自于5-甲基胞嘧啶, 而尿嘧啶残基被当作胸腺嘧啶复制, 通过这种方式可有效保留DNA的甲基化信息。

2、 MIP引物 MIP引物设计位于需检测的甲基化位点两侧, 同时成比例的扩增甲基化及未甲基化的部分。为解决PCR偏倚, Wojdacz等 [ 报道在MlP引物中引入有限的CpG位点, 并通过控制退火温度来有效控制PCR偏倚; Shen L等[报道仅通过提升退火温度即足以抵消PCR偏倚; Chhibber等[报道通过单DNA分子的PCR可克服PCR偏倚的现象。

亚硫酸氢盐基因测序:亚硫酸氢盐修饰PCR扩增后的DNA测序, 传统上被认为是DNA甲基化分析的金标准。Weisenberger等[报道了一种数字化亚硫酸氢盐基因测序法, 可对单分子进行测序而无需挑克隆。该方法通过样本稀释至标准水平, 尽可能将反应中模板分子减至更小。并通过同一样本的多重反应(每个样本至少进行96个反应), 将数字化分析后合理阳性样本进行测序, 极大的节约了时间及精力。

焦磷酸法测序:通过DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶及反应底物5'磷酰硫酸、荧光素的酶级联反应, 使得每一个dNTP的聚合酶与一次荧光信的释放偶联, 可极大提高检测的敏感性。但焦磷酸测序的准确性受制于片段长度, CpG与前向引物3'端的距离也可影响检测结果的准确性。

结合亚硫酸盐的限制性内切酶分析:使用限制性酶消化PCR产物后分甲基化和未甲基化的DNA。用亚硫酸盐修饰后, 甲基化和未甲基化的DNA测序的差异可以导致新的甲基化依赖的限制性位点的产生, Xiong等[发展的“ 联合亚硫酸盐限制性分析” 通过将琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳产物消化后杂交分析, 可定量检测甲基化位点。

甲基化敏感性单核苷酸引物延伸MEIHYLA-TION— SENSITIVE SINGLE— NUCLEOTIDE PRIMER EXTENSION(MS-SnuPE):单核苷酸引物延伸技术更初用于单核苷酸突变分析, Gonzalgo等[将其发展后应用于DNA的甲基化研究。首先应用MIP引物扩增所需检测序列, 凝胶产物分离后退火加入内部引物。内部引物在DNA聚合酶的作用下聚合32P标记的dCTP或者dTTP延伸, 产物可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

甲基化敏感熔解曲线分析:亚硫酸盐处理后获得的甲基化与未甲基化DNA间序列的差异, 可通过熔解曲线分析技术发现, 因为甲基化DNA含有更多的GC相对更难熔解。甲基化分析时可通过熔解温度及峰型的变化轻易的分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。近年高分辨率熔解(high resolution melting, HRM)技术的发展带来了应用上的优势[, HRM方法熔解曲线更光滑, 可检出更微小的别。HRM方法可检测传统的MIP引物, 也可以在MIP引物中引入少量的CpG位点来修正PCR偏倚并提高分析敏感性。MIP加入CpG位点的方法可将PCR偏倚推向甲基化一侧, 并通过退火温度的控制可明显提升分析敏感性[。

碱基特异性裂解和引物延伸的MALDI-TOF质谱测定:在MIP引物的基础上引入MALDI-TOF质谱法分析产物, 其敏感性较高, 可准确检出5%的甲基化, 适用于高通量样本[。但由于其需要昂贵的设备, 方法具有复杂性, 限制了其临床应用。

重甲基法:Cottrell等[报道了MIP引物基础的定量甲基化检测方法, 将之命名为重甲基法(HEAVYMETHYL)。首先在MIP引物基础上添加了寡核苷酸阻断剂别甲基和未甲基化等位基因, 阻断剂只识别未甲基化片段。当存在甲基化位点, 寡核苷酸探针无法结合, 引物顺利结合并加以扩增, 而非甲基化位点扩增则受到抑制。重甲基法中阻断剂在每一个PCR循环均提供特异性识别, 所以其阳性率类似MSP方法, 并具有高通量、闭管的特点。

3、 甲基化特异性PCR引物 MSP引物是指在引物设计中包括入甲基化位点, 扩增时只扩增甲基化DNA, 避免了MIP引物带来的PCR偏倚的现象。MSP引物随着循环数的增加可以带来极高的敏感性, 但通常伴随着相当高的阳性率[。引物事件(引物序列与模版不匹配但依然扩增)及未完全亚硫酸氢钠转化都会引发阳性的结果。

甲基化特异性PCR:是更为经济实用的方法, 无需特殊仪器, 是目前应用更为广泛的方法。传统的MSP方法中, 通常设计第2套引物用于扩增未甲基化片段, 并与MSP引物同时扩增经亚硫酸氢钠处理的DNA模版, 扩增后通过凝胶电泳比较条带强度来估算甲基化水平。MSP方法有极高的成本效益比, 但前提是避免阳性的结果, 此外PCR反应管应尽可能避免被打开以防止污染。

定量甲基化特异性PCR:使用荧光水解探针, 在MSP扩增同时检测荧光强度, 使得定量检测甲基化成为可能[。这一技术被命名为methylight, 克服了大多数MSP存在的问题:首先, 只有当探针与引物杂交时, 才会观察到扩增, 从而消除任何非特异性扩增的信。扩增产物无需进行凝胶分析, 可以闭管大通量进行检测。其次探针序列中添加更多的CpG位点使错启动事件的可能性变得更小, 不完全转化导致的阳性可被探针序列中的许多非CpG胞嘧啶限制。但探针的引入会增加设计的复杂性, 且探针有可能无法检出杂合甲基化。

SYBR GREEN基础的定量MSP:以荧光染料插入双链DNA为基础的定量MSP方法正逐渐取代探针法。这一方法发端于将SYBR Green I染料用于凝胶电泳分析PCR产物。SMART-MSP(实时MSP之后的敏感的熔解分析)同样基于HRM原理, 通过双链DNA中内插入荧光染料的原理获得实时的荧光信。实时的MSP反应将CT值进行指数转化后通过与标准浓度的比较可以得到未知基因的定量结果[。SMART-MSP继承了HRM方法的高敏感性、高通量、低污染的特点。对引物引发的阳性结果是一种适合的解决方法。但不适用于不完全转化引起的阳性, 可能导致的甲基化水平的估计过高。

定量MSP-甲基化特异性荧光扩增(MS-FLAG):Bonanno等[报道的新颖的定量检测甲基化的方法, 热稳定的PspGI核酸内切酶切割MSP引物产生荧光信。引物寡核苷酸链的5尾端携带荧光染料及淬灭剂, 染料与淬灭剂间被核酸内切酶识别。扩增的甲基化片段数量与荧光信强度成正比。

四、甲基化检测准确度

DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。

一、DNA甲基化的生物学作用

1、DNA甲基化与肿瘤

甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2(IGF-2)基因印记丢失导致多种肿瘤。

所以甲基化可以作为一个比较理想的肿瘤早期诊断的生物标志物和预后评估指标，对肿瘤的查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。

2、DNA甲基化与遗传印记、胚胎发育

DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的。此外，等位基因的抑制(allelic

repression)被印记控制(imprinting control regions,

ICRs)所调控,该域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾。

二、DNA甲基化的检测方法

随着DNA甲基化研究的不断深入，其检测方法也出不穷。这些方法针对不同研究目的，运用不同的处理方法，几乎涵盖了从基因到基因组各个次水平的研究。据检测样本不同，可以分为DNA和mRNA。现有方法，绝大部分都是取样于细胞的DNA，方法如下：

1、 基因组整体水平甲基化分析

a) 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法

b) SssI 甲基转移酶法

c) 免疫化学法

d) 氯乙醛法

2、 动物血清elisa试剂盒特异性位点的DNA甲基化的检测

a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法

b) 直接测序法

c) 甲基化特异性的PCR

d) 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)

e) 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(bined bisulfite restriction analysis，COBRA)

f) 甲基化敏感性单链构象分析

g) 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳

h) 甲基化敏感性解链曲线分析(methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA)

i) 荧光法(Methylight)

j) DNA微阵列法

k) 甲基化敏感性斑点分析(methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA)

l) 甲基化特异性多连接依赖性探针扩

3、甲基化新位点的寻找

a) 限制性标记基因组扫描(restriction landmark genomic scanning，RLGS)

b) MBD(Methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化结合)柱析法

c) 动物血清elisa试剂盒联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD

五、甲基化测序

(1) 甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

(2)亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，更后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

(3) 高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

(4) 基因组直接测序法

基因组直接测序法是过去一直沿用的DNA甲基化的研究方法，用Maxam—Gilbert化学裂解法对基因组DNA进行处理，并以连接介导的PCR来放大信强度，然后进行序列分析。此法是基于5mC在标准的Maxam—Gilbert胞嘧啶化学裂解反应中不被裂解，故5mC可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴定。如采用MnO4- 哌啶法，结果则反之因此在检测5mC时，此两法可提供完全互补的检测信息。该法与LM-PCR结合后，大大降低了对基因组DNA的需要量（1～2 ng）。当5mC和C同时处于不同DNA分子上的同一位点时，该位点至少要有25%的5mC才能被N2H4法检测到；MnO4-法比N2 H4法更灵敏。因为这两种基因组DNA化学修饰法均有抑制DNA聚合酶延伸的特性，无须进行DNA哌啶裂解就可通过基因组直接测序技术进行甲基化分析。

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